Ефективність лікування розсіяного склерозу за допомогою мезенхімальних стовбурових клітин

Розсіяний склероз є демієлінізуючим захворюванням центральної нервової системи, що має багатофакторну етіологію та патогенез і супроводжується швидкою інвалідизацією пацієнтів переважно молодого працездатного віку.

Етіологію РС розглядають як вплив несприятливих чинників зовнішнього середовища при генетичній схильності організму (дефекти системи лейкоцитарних антигенів, HLA). Такими несприятливими факторами можуть бути: вірусна чи бактеріальна інфекція, недостатня інсоляція та дефіцит вітаміну D.

У патогенезі РС провідне місце належить імунопатологічним реакціям у вигляді дисбалансу між субпопуляціями Т-лімфоцитів та порушень у системі комплементу, накопичення прозапальних медіаторів, слідом за якими йде процес дегенерації аксонів, апоптоз клітин глії. Результатом є стійкий неврологічний дефіцит.

Процеси ремієлінізації відбуваються тоді, коли у пацієнта клінічно спостерігається ремітуючий тип перебігу захворювання, і у порівнянні з процесами демієлінізації є значно слабшими. 

Зважаючи на складність патогенезу та мультифакторну етіологію, у лікуванні РС також нема єдиного ефективного підходу. Одним із перспективних підходів у лікуванні РС є застосування мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) різного походження. Доцільність такого підходу обґрунтовано рядом експериментальних робіт, а також клінічними дослідженнями, які вказують на безпечність лікування РС за допомогою МСК. Невирішеними залишаються питання клінічного ефекту та динаміки неврологічного дефіциту при комбінованому застосуванні стовбурових клітин у пацієнтів із РС. 

Найбільш оптимальним джерелом МСК є пуповина, так як ці клітини більш “молоді”, і їм не притаманна така кількість мутацій, як у МСК дорослого організму. Застосування аутологічних МСК у пацієнтів із аутоімунними захворюваннями є дискутабельним питанням, так як вони також є дефектними, не проявляють імуномодулюючих властивостей відносно реципієнта, і ефективність від застосування таких МСК є сумнівною.

Мета дослідження. Метою дослідження було вивчення ефективності та безпечності комбінованого застосування мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин пуповини у лікуванні розсіяного склерозу.

Матеріали і методи. Дослідження виконувалося на базі Відділення відновлювальної нейрохірургії з рентгенопераційною, ДУ “Інститут нейрохірургії ім.акад.А.П.Ромоданова НАМН України” в рамках пошукової НДР “Дослідити ефективність регенеративних клітинних технологій у нейрохірургічному лікуванні хворих із демієлінізуючими захворюваннями ЦНС та дитячим церебральним паралічем”. Проведення дослідження схвалено на засіданні комітету з біоетики ДУ “Інститут нейрохірургії ім.акад.А.П.Ромоданова НАМН України” №1 від 17.01.20р. З усіма пацієнтами підписана Інформована згода на участь у дослідженні.

Критерії включення пацієнтів у дослідження:

1. вік пацієнтів 18-55 років;
2. верифікований діагноз РС згідно критеріїв McDonald (2010р.);
3. кількість балів за шкалою EDSS від 1 до 7,5, погіршення неврологічного статусу >1 бала за шкалою EDSS протягом останнього року, що вказує на прогресування захворювання;
4. відсутність ефекту від лікування хворобомодифікуючими препаратами;
5. відсутність факту лікування моноклональними антитілами;
6. підписана Інформована згода на участь у дослідженні.

Критерії невключення пацієнтів у дослідження:

1. вагітність;
2. контрактури у кінцівках;
3. тяжка супутня соматична патологія (серцева недостатність за NYHA III-IV ст., інфаркт міокарда, ниркова недостатність (ШКФ≤59 мл/хв), кахексія);
4. гострий інфекційний процес (T тіла ≥ 37,2°С), позитивний ПЛР тест на COVID-19;
5. психічні порушення;
6. злоякісні новоутворення.

Протокол підготовки мезенхімальних стовбурових клітин пуповини.  Мезенхімальні стовбурові клітини пуповини для даного дослідження підготовлено ТОВ «Медична біотехнологічна компанія «Гемафонд» в рамках угоди про науково-практичне співробітництво від 05.11.19р. Пуповини були отримані від здорових доношених дітей після підписання інформованої згоди з батьками
Пуповину (n=3) зберігали в асептичних умовах (не більше 2 діб) при температурі  4°С у стерильному фізіологічному розчині (PS; 0,9% в/в хлориду натрію) до обробки. Для виділення мезенхімальних стовбурових клітин пуповину поміщали в стерильні чашки Петрі і промивали фосфатидилсерином  з додаванням 5% антибіотик-антимікотичного розчину (Sigma, США).

Тканину пуповини очищали від згустків крові і розрізали на шматочки або експлантати приблизно 1–1,5 см. Потім експланти поміщали в культуральні колби об’ємом 75 см2 (1-2 експланта на колбу) і культуральне середовище додавали в кожну колбу. Культуральне середовище складалося з: модифікованої суміші Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM-F12; Gibco), що містить 5% фетальної бичачої сироватки (Capricorn; Німеччина), 2 мм L-глутаміну (Capricorn; Німеччина) і 1 мкг/ мл амфотерицину (Козеріг; Німеччина). Експланти/клітини культивували протягом 2-3 тижнів на культуральному середовищі, яке змінювали кожні 2-3 дні, та у вологому СО2-інкубаторі з 5% СО2 у повітрі при +37°С.

Через 8 днів тканину оглядали під фазово-контрастним світловим мікроскопом для моніторингу міграції клітин. Клітини спочатку пассували при 80% злиття моношару; для досягнення цього клітини відокремлювали від поверхні колби за допомогою 0,05% трипсину-ЕДТА (Sigma; США) і переносили в культуральні колби 175 см2 для посіву при щільності 4-5x103 клітин/см2 і культивували ще 2- 3 уривок.

МСК, отримані з пуповини, мають типову фібробластну морфологію. Для введення використовували 2-й  або 3-й пасаж мезенхімальних стовбурових клітин пуповини.

Відсоток життєздатних МСК у суспензії клітин, оцінений флоуметрією, становив 93,93%±0,79% (n=3).
Мезенхімальні стовбурові клітини, виділені з пуповини людини, аналізували на профіль експресії поверхневих маркерів при 2-му пасажі CD34, CD45, CD19, HLA-DR, CD73, CD90 і CD105. Відомо, що культивовані МСК є сильно позитивними на експресію CD73 (99,53%±0,13%), CD90 (99,80%±0,06%) і CD105 (99,53%±0,23%) і негативні на експресію CD34 (0%), CD45 (0,0%), CD19 (0%) і HLA-DR (0,01%±0,01%). Відповідно до мінімальних критеріїв, встановлених Комітетом з мезенхімальних і тканинних стовбурових клітин Міжнародного товариства клітинної терапії.

Мезенхімальні стовбурові клітини пуповини були також перевірені на диференціацію в адипоцити, хондробласти та остеобласти in vitro забарвлені олійним червоним, альціановим синім і алізариновим червоним відповідно.

Протокол лікування. Усім пацієнтам (n=27) проводився загальний огляд, а також комплекс лабораторно-інструментальних обстежень, який включав: загальний аналіз крові, загальний аналіз сечі, біохімічний аналіз крові (глюкоза, білірубін, сечовина, креатинін, АлТ, АсТ, холестерин), імунограма з визначенням рівня нейроаутоантитіл, МРТ головного мозку та шийного відділу хребта з контрастним підсиленням, електроенцефалографію (ЕЕГ), електронейроміографію (ЕНМГ) з транскраніальною магнітною стимуляцією (ТМС), зорові викликані потенціали, консультації суміжних спеціалістів за показами.

Пацієнти розділялися на дві групи. За типом клінічного протікання у групі 1 у 9 пацієнтів діагностовано прогресуюче-ремітуючий (75%) тип захворювання, у 3 – первинно прогресуючий (25%). Середній вік пацієнтів у групі 1 був 35,25±13,72р. Пацієнтам групи 1 (n=12) було проведене комбіноване лікування з використанням культивованих мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) пуповини, з характеристиками якості, наведеними нижче.

Пацієнти групи 1 отримували сумарну дозу МСК з розрахунку 1×10⁶/кг ваги одноразово, з яких 20×10⁶ вводили інтратекально, а решту матеріалу в/в. Інтратекальне введення проводилося за типовою методикою виконання люмбальної пункції з дотриманням правил асептики та антисептики в умовах маніпуляційного кабінету з використанням місцевого знеболення. Попередньо  Групою порівняння була група 2 (n=15), пацієнти якої проходили лікування згідно Протоколу лікування розсіяного склерозу. Середній вік пацієнтів у групі 2 був 39,8±10,23р.  За типом клінічного протікання у 12 пацієнтів був прогресуюче-ремітуючий тип протікання (80%), у 2 – первинно-прогресуючий (13,4%), у 1 – вторинно-прогресуючий (6,6%). Критерії включення та невключення у дослідження наведені вище.

Ключовими точками спостереження були: 1 місяць, 6 місяців, 1 рік.

Точкою відліку періоду спостереження вважався день введення МСК. Повторне введення МСК проводилось через 6 місяців після першої процедури, після проведення контрольного огляду. 

Об`єктивна оцінка клінічного стану пацієнтів проводилась за розширеною шкалою оцінки ступеня інвалідності за Kurtzke - Expanded Disability Status Scale (EDSS)). Спастичність оцінювали за шкалою Ashworth.

Статистична обробка даних. Для статистичної обробки даних використовували програмний пакет STATISTICA 10.0 з ліцензійним програмним забезпеченням. Достовірність різниці між показниками визначали за допомогою t критерію Стюдента. Статистично достовірним вважалося значення р˂0,05.

Результати та їх обговорення. Середній вік хворих у групі 1 був 35,25±13,72. У групі 2 – 39,8±10,23. Середня тривалість захворювання до моменту госпіталізації у відділення в пацієнтів обох груп (n=27) складала 6,8 року. Переважаючу кількість пацієнтів складали жінки. У групі 1 співвідношення жінок : чоловіків було 8 : 4, у групі 2 – 9 : 6.

Середній показник EDSS у групі 1 був 5,583±1,346 при госпіталізації пацієнтів. Через 1 місяць після лікування МСК, не спостерігали статистично достовірної динаміки показника EDSS, який складав 5,375±1,245 (р=0,169). Достовірна позитивна динаміка за шкалою EDSS спостерігалася через 6 місяців після лікування - 4,583±0,973, у порівнянні із значенням показника до лікування (р=0,024) і через 1 місяць після лікування (р=0,031). Виявлено також достовірну різницю у значенні EDSS через 1 рік після першого лікування МСК 4,208±0,891, у порівнянні з показником до лікування (р=0,003), а також з показниками через 1 місяць (p=0,003) та 6 місяців (p=0,0007).

У групі 2 середній показник за шкалою EDSS до лікування був 5,8±1,293. Через 1 місяць показник був 5,433±1,163 (р=0,011), через 6 місяців - 5,567±0,799 (р=0,278), через 1 рік - 5,6±0,91 (р=0,239). У динаміці статистично значущої різниці під впливом проведеного лікування відмічено не було.

При порівнянні груп 1 і 2, не виявлено статистично значущої різниці між показником EDSS при госпіталізації (р=0,337) та через 1 місяць після лікування за допомогою МСК (р=0,485). Різниця показника між групами відмічена на 6 тижні після лікування (р=0,003) та через 1 рік (р=0,0002).

При оцінюванні спастичності у пацієнтів групи 1 середнє значення у балах за шкалою Ashworth до лікування було 1,75. В динаміці, через 1 місяць після застосування МСК пуповини середнє значення за шкалою було 1,41 і виявилося статистично незначущим (р=0,317). Позитивна динаміка виявлена через 6 місяців, подібно до динаміки показника неврологічного дефіциту за шкалою EDSS. У порівнянні із першим місяцем спостереження середній бал спастичності складав 1, і різниця була статистично значущою у порівнянні з показником до лікування (р=0,008). Через 1 рік після першої ін`єкції МСК пуповини і 6 місяців після другої, спостерігалося подальше зменшення спастичності, середнє значення показника було 0,83 (р=0,001). При оцінюванні спастичності у пацієнтів групи 2, середнє значення у балах за шкалою Ashworth до лікування було 1,8. Через 1 місяць після курсу лікування (міорелаксанти) середнє значення за шкалою було 1,54 і виявилося статистично значущим (р=0,02). Через 6 місяців, порівнянні із першим місяцем спостереження середній бал спастичності у групі 2 складав 1, і різниця була статистично незначущою у порівнянні з показником до лікування (р=0,066). Через 1 рік після лікування, не спостерігалося зменшення спастичності, середнє значення показника було 1 (р=0,063)

У порівнянні показника спастичності у двох групах пацієнтів у різних часових проміжках різниці до лікування не виявлено (р=0,468). Після першого місяця лікування у 2-х групах різниця була статистично не достовірною (р=0,426). Після 6 місяців статистично значущої різниці між групами також не виявлено (р=0,5). Зменшення спастичності, яке було статистично значущим, спостерігалося через 1 рік на користь групи 1, після другого застосування МСК пуповини (p=0,04).

Отримані результати свідчать про відсутність покращення неврологічного статусу у перший місяць після лікування пацієнтів за допомогою МСК пуповини. Позитивний ефект спостерігався протягом 6 місяців після лікування і продовжував наростати в динаміці до 1 року. Це говорить про необхідність продовження періоду спостереження, і визначення ефективності МСК у віддаленому періоді.

Регрес спастичності наступає дещо пізніше, через 6 місяців різниця у групі 1  (за шкалою Ashworth) в динаміці статистично не достовірна. Достовірне зниження спастичності спостерігалося у часовій точці, що відповідала 1 року після першого застосування, і 6 місяцям після другого застосування.

Отримані дані узгоджуються з даними інших авторів, стосовно особливостей впливу МСК на перебіг аутоімунного процесу, що ймовірно пов`язано з імуномодулюючим ефектом.

У групі 1, у 4 з 12 (34%) пацієнтів спостерігався головний біль після проведення процедури, який полегшувався прийомом нестероїдних протизапальних препаратів і проходив повністю через 8-12 годин. У 3 (25%) пацієнтів зафіксований підйом температури тіла до 38,6⁰С, що також купувався симптоматичною терапією. Серед інших реакцій після введення МСК, спостерігали загальну слабкість у перший тиждень після лікування у 8 з 12 (67%) пацієнтів, яка проходила без специфічного лікування. Отримані дані дозволяють говорити про безпечність процедури і необхідність проведення досліджень на більших групах пацієнтів.

Головними недоліками даного дослідження є невелика вибірка хворих та достатньо малий час спостереження. Проте, спостереження за пацієнтами продовжується для визначення віддалених наслідків та стійкості позитивного ефекту.

Висновки.

1. Комбіноване лікування мезенхімальними стовбуровими клітинами пуповини достовірно покращує стан хворих із розсіяним склерозом та сприяють регресу неврологічного дефіциту.
2. Мезенхімальні стовбурові клітини пуповини достовірно зменшують спастичність і покращують рухову функцію при розсіяному склерозі.
3. Лікування за допомогою мезенхімальних стовбурових клітин пуповини є безпечним, а реакції після їх застосування є короткочасними і не потребують специфічної терапії.

Детальні результати дослідження  опубліковані в International Journal of Morphology

Результати досліджень український науковців також були представлені на міжнародному конгресі Cord Blood Connect  2022, який відбувся в Маямі, США. Стендова доповідь «Застосування стромальних/стовбурових клітин пуповини для лікування спастичності при розсіяному склерозі»,  опублікована і в науковому журналі асоціації STEM CELLS Translational Medicine*

_{*STEM CELLS Translational Medicine  - офіційний журнал Асоціації пуповинної крові (Cord Blood Association). Асоціація пуповинної крові та Oxford University Press оголосили  про партнерство, у рамках якого STEM CELLS Translational Medicine є офіційним науковим журналом CBA.  Журнал має розділ про дослідження пуповинної крові та пренатальних тканин, а  також публікує прийняті тези міжнародного конгресу Cord Blood Connect.}